16S/18S/ITS等扩增子测序（二代）

服务介绍：

扩增子测序：提取环境样品的DNA，选择合适的通用引物扩增16S/18S/ITS的目标区域，通过检测目标区域的序列变异和丰度，以研究环境微生物多样性及群落组成差异。基于DNBSEQ-G99基因测序仪，可对动物粪便、土壤等环境样本测序，适用于微生物16S/18S/ITS、宏基因组测序等科研场景。

16S送样登记单.xlsx

分析内容：

实验结果展示：

1、OUT（Operational Taxonomic Units）操作分类单元图

2、门水平柱状图

实验流程：

TotalDNA抽提与质检-目标区域PCR扩增-文库构建-上机测序-数据分析；

送样运输要求：

以下所有样本必须在送样管上标记清楚样本编号，-80℃冰箱冻存（-80℃冻存时间不超过六个月），全程干冰运输送样。采集的标本应盛于无菌容器内，确保所采集的标本无外源性的污染。16s原则上不返样，确需返样务必提前说明，建议合理送样，如送样量过多会进行销毁。

一、 粪便样本

A. 带上手套收集新鲜的粪便样品，人的粪便量为500mg，大鼠为1-2粒，小鼠为3-5粒，收集后分装至 2mL EP 管（无菌）或冻存管（无菌）中，迅速放入液氮中速冻，之后放于-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

B. 人的粪便样本可用无菌牙签或粪便取样器截取样品中段内部（避免表层中的肠道膜脱落细胞），外部容易污染且细菌DNA 由于接触空气可能有降解。二、动物肠道内容物样本

1 普通动物肠道内容物

A. 在实验对象死亡后，无菌条件下，取出整个肠道，用无菌解剖刀切取所需肠段。用无菌手术刀挖取内容物，并立即放在冰上进行分装及标记将已取的样品分装至2mL EP 管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管组织量为0.5~1g，每个样品分装2~3 管备份，迅速放入液氮中速冻，之后放于-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

B. 注意事项：一些肠道内容物较难取样的可以取肠道样本作为研究对象，此类型样本无法出去宿主本身的核酸，检测建库结果存在宿主基因的风险，若介意宿主基因干扰，需要分离出肠道内溶物再送样。液氮速冻，-80℃长期保存，干冰运输。注意若为微生物多样性Q-MCD 产品类型的样本，样本量每管组织量为0.5~2g，太少无法准确称量样本重量。

2 飞虱类昆虫肠道样本

A. 取褐飞虱成虫200+头，用冰（-20℃冷冻）使其昏迷，用70%乙醇进行表面灭菌处理，在用灭菌水漂洗数次。

B. 解剖镜下用镊子夹住飞虱的头胸部和腹末，轻轻用力将肠道以及内脏器官拉出，用灭菌水漂洗，去除卵巢、脂肪以及其他内脏器官，取出肠道放于1.5mL离心管，每管组织量为0.25~0.5g，每个样品分装2 管备份分装好后样本迅速放入液氮中速冻，之后放于-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

三、土壤样本

1 普通土壤样本

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点。

B. 除去土壤表层未分解的凋落物层，用已灭菌的刀或铲去除表层5cm 的土壤，再用烧灼过的勺、铲或土壤取样器取样10-25g，装于无菌塑料封口袋内，多

点样本均匀混合（注意保留适当空间） ，标明采样地点，深度、日期等信息。

C. 两天内常温或冰袋运送到实验室，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品捣碎，过2mm 筛后，分装至2mL 或更大体积的EP 管或冻存管中；每管

土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g，若土壤含微生物较少，需增加送样量。

D. 未分装样本4 ℃保存时间不要超过一个月，分装后样本-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

2 根际土壤样本

A. 收集植物植株，去除根部大块土壤；摇动植株去除附着不紧密的土壤，使用无菌刷子收集根部附着紧密的土壤；随机多点取样5-10g，装于无菌塑料封口袋

内，多点样本均匀混合（注意保留适当空间） ，标明采样地点，深度、日期等信息。

B. 两天内常温或冰袋运送到实验室，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品捣碎，过2mm 筛后，分装至2mL 或更大体积的EP 管或冻存管中；每管土

壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g，若土壤含微生物较少，需增加送样未分装样本4 ℃保存时间不要超过一个月，分装后样本-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

3 淤泥样本

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点。

B. 采集污泥样品，放于无菌离心管或其它无菌容器中。

C. 4 小时内常温带回实验室中分装至2mL EP 管或冻存管中；或用PBS 进行清洗，使用PBS 的体积需是淤泥样本的3-10 倍，摇床混匀孵育1-2h 或者使用超声波清洗仪清洗15-30min，瞬离（转速达到800g 即可停止），将上清液转至新的合适体积的离心管中，8000g 4℃离心10min 收集沉淀或下层，分装于2 mL 离心管中；每个样品至少2g。

D. 分装后样本迅速液氮速冻，之后放于-80°C 或液氮中长期保存，干冰送样。

4 水体样本

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点。

B. 采用多点取样法取样，采样时不可搅动水底的沉积物；避免手指和其他物品对瓶口的沾污。

C. 取样后4 小时内（期间4 ℃避光保存）真空抽滤、富集菌体（平行重复样本可用同一滤膜过滤）。

D. 带有富集菌体的干燥滤膜剪碎或折叠后（直接保存，剪碎或者折叠有可能吸附菌体的一面会粘在一起，不利于提取时裂解洗脱菌体）保存在2mL 或5mL 无菌EP 管中， -20℃或-80℃保存，干冰送样。

E. 如果没有滤水设施，可将水体收集后，使用50ml 无菌离心管8000g 4℃离心10min 收集下层， -20℃或-80℃保存，干冰送样。

F. 注意事项：

a. 过滤大量低微生物含量的清亮水样用0.22μm 的聚苯醚砜滤膜（Polyethersulfone），每个样本至少1L 水样。

b. 浑浊水样使用0.22μm 滤膜过滤缓慢容易堵塞时，建议使用0.45μm 的混合纤维素酯滤膜（膜醋酸纤维素、硝酸纤维素）；如水体中含有杀虫剂和除草剂，则避免使用这类滤膜；每个样本0.5L-1L 水样，如有堵塞则将同一样本滤膜保存于一管。

c. 如果水样中不可溶解的颗粒较多，需要使用2-5μm 孔径的滤膜将不可溶解的颗粒杂质滤去，再使用0.22μm 或0.45μm 的滤膜富集菌体；每个样本0.5L-1L 水样，如有堵塞需则同一样本滤膜保存于一管。

d. 如果研究的是病毒，则需先用0.22μm 滤膜把水中的细菌和其它大个头细胞过滤掉，再用带正电荷滤膜（ Virozorb 的1MDS 或NanoCeram 的Virus Sampler cartridges）富集病毒；每个样本20L 水样。

e. 微生物含量低的清亮水体可使用多管50ml 分装离心，合并下层进行二次离心富集，富集后体积不能太大（200ul-500ul），需要一次性提取全部富集体积样本。

四、物体表面微生物样本

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点。

B. 采集样品，放于无菌离心管或其它无菌容器中。

C. 4 小时内常温带回实验室中，取10g 样品（评估物体表面微生物含量确定样本量，加入50-100mL 的PBS 缓冲液或者无菌水，150-200r/min 振荡30-60min，超声5min，再150-200r/min 振荡30-60min，取上清液加入到50mL离心管中，8000-10000g 离心收集沉淀。将沉淀收集到2ml 离心管中，沉淀量不能太多，在200-500ng 之间最佳。若沉淀不明显可过0.22uM 的可拆卸的滤膜，一个样品最好富集多个滤膜，以便提高提取效率，将过滤好的滤膜置于无菌离心管中，液氮速冻，-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

D. 也可使用无菌脱脂棉签或者拭子擦拭物体表面，保证取样的准确性即可，反复擦拭30 次左右，液氮速冻，干冰送样。

五、棉拭子样本

1 生殖道拭子

A. 48h 内无性行为，不得进行私处清洗、上药等易改变菌群结构的行为，30 天内不能用抗生素和抗真菌类药物。

B. 根据实验要求用无菌棉拭子（可用无菌生理盐水浸润）从阴道后穹窿、中间点、入口处沿壁擦拭5 次后，用剪刀将棉拭子头部（2-3 个）剪入冻存管中液氮速冻，-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

2 口腔软组织

A. 取样前可轻轻漱口去除口腔大块食物残渣，但请勿大量多次以避免微生物损。

B. 棉拭子取样;用棉拭子刮取，刮取后将棉拭子头（2-3 个）剪下放入EP 管（无菌）或冻存管（无菌）中，液氮速冻，-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

C. 注∶棉拭子可用无菌生理盐水润湿，以增加微生物附着率。

3 咽部拭子

A. 用灭菌棉拭子在受试者咽后壁旋转一周，避免触及舌、口颊粘膜和唾液。

B. 将棉拭子头（2-3 个）剪下放入EP 管（无菌）或冻存管（无菌）中。

C. 液氮速冻，-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

4 直肠拭子

A. 肥皂、水和70%酒精清洗肛门周围。

B. 将无菌拭子用生理盐水湿润后插入肛门4-5cm（幼儿2-3cm），在肛门括约肌处轻柔旋转，于肛门隐窝处取样,放入无菌EP 管或冻存管中。

C. 液氮速冻，-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

 六、肺泡灌洗液样本

A. 小鼠麻醉并固定，颈部去毛并消毒;颈部正中切口，暴露剥离气管，并在气管近端穿线打活结（要稍松）;在所打活结的远端，剪开气管的1/2，行气管插管，插入后线打死结。

B. 1mL 注射器抽取1mL 灭菌生理盐水，通过气管插管注入气管内（针头不要插太深，以免损伤肺），反复抽吸三次，将液体（约0.7mL）抽出，置于无菌EP 管或冻存管中。

C. 重复上述操作两次（每次抽出约0.9mL 肺泡灌洗液），置于无菌EP 管或冻存管中。

D. 0.2μm 滤膜过滤或离心富集灌洗液，滤膜或沉淀液氮速冻，-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

七、牙菌斑样本

A. 取样前可轻轻漱口去除口腔大块食物残渣，但请勿大量多次以避免微生物损失。

B. 记录牙菌斑取自哪颗牙齿，如臼齿，前臼齿，门牙；取龈上牙菌斑还是龈下牙菌斑。

C. 干燥即将取样的部位，用刮匙刮取尽可能多的牙菌斑（注意丢弃有出血的样本），最后将刮匙浸没到有buffer 的无菌EP 管或冻存管中，取样重量0.5-1g。

D. 用自封袋封存，标记好，置于冰上，2h 内运输到实验室，-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

八、生物膜样本

A. 根据研究目的选择有代表性的取样地点及采样点。

B. 用脱脂棉将生物膜上的微生物擦拭干净，脱脂棉立即放入样品瓶中，并加入50mL 灭菌的生理盐水，盖盖，用力震荡20min，使脱脂棉上生物膜微生物进入水中，形成悬浮菌液。

C. 悬浮的菌液用0.22um 的滤膜过滤。将滤膜折叠、剪碎置于无菌离心管中，液氮速冻，-80℃或液氮中长期保存，干冰送样。

 注：未涉及到环境样品取样之前请和实验室沟通，避免送样出现问题，耽误项目进程。

仅供科研用途，不可用于临床诊断！